分光光度法如何建立標準曲線

分光光度法是通過測定被測物質在特定波長處或一定波長范圍內光的吸光度或發光強度，對該物質進行定性和定量分析的方法。

1 簡介

在分光光度計中，將不同波長的光連續地照射到一定濃度的樣品溶液時，便可得到與不同波長相對應的吸收強度。如以波長（λ）為橫坐標，吸收強度（A）為縱坐標，就可繪出該物質的吸收光譜曲線。利用該曲線進行物質定性、定量的分析方法，稱為分光光度法，也稱為吸收光譜法。用紫外光源測定無色物質的方法，稱為紫外分光光度法；用可見光光源測定有色物質的方法，稱為可見光光度法。它們與比色法一樣，都以Beer-Lambert定律為基礎。 上述的紫外光區與可見光區是常用的。但分光光度法的應用光區包括紫外光區，可見光區，紫外光區。波長范圍

(1)200～400nm的紫外光區，(2)400～760nm的可見光區， (3)2.5～25μm(按波數計為4000cm<-1>～400cm<-1>)的紅外光區。

2 檢測儀器

紫外光度計，可見分光光度計（或比色計）、可見分光光度計或原子吸收分光光度計。為保證測量的精密度和準確度，所有儀器應按照國家計量檢定規程或本附錄規定，定期進行校正檢定。

3 基本原理

當一束強度為I0的單色光垂直照射某物質的溶液后,由于一部分光被體系吸收,因此透射光的強度降至I,則溶液的透光率T為:

根據朗伯(Lambert)-比爾(Beer)定律:

A=abc

式中A為吸光度，b為溶液層厚度（cm），c為溶液的濃度（g/dm^3)， a為吸光系數。其中吸光系數 與溶液的本性、溫度以及波長等因素有關。溶液中其他組分（如溶劑等）對光的吸收可用空白液扣除。

由上式可知，當固定溶液層厚度l和吸光系數a時，吸光度A與溶液的濃度成線性關系。在定量分析時，首先需要測定溶液對不同波長光的吸收情況（吸收光譜），從中確定zui大吸收波長 ，然后以此波長 的光為光源，測定一系列已知濃度c溶液的吸光度A，作出A~c工作曲線。在分析未知溶液時，根據測量的吸光度A，查工作曲線即可確定出相應的濃度。這便是分光光度法測量濃度的基本原理。